摘要 HBF工艺（hybridbiological&fixedfilmtechnology）是废水处理的一种有效方法，且填料是该工艺的核心。然而，典型填料对污水处理性能的影响及其机制并不清楚。为此，采用软性填料（RT）、弹性填料（TT）、组合填料（ZT）、酶浮填料（MT）、聚酯填料（JT）和涤纶填料（DT）6种填料构建HBF反应器处理生活污水。结果表明，测试期内COD平均去除率差异不显著（P＞0.05），而氨氮的平均去除率差异显著（P＜0.05），且MT反应器的COD及氨氮平均去除率均最高。为揭示其差异形成原因，比较了不同反应器内生物膜干重、微生物活性、微生物群落组成及硝化细菌功能基因（amoA、NSR）的表达。结果发现，生物膜干重差异显著（P＜0.05）且微生物活性差异显著(P＜0.05)，生物膜上的细菌群落结构不同但优势菌群均为变形杆菌门、拟杆菌门及厚壁菌门等，MT中amoA、NSR拷贝数均显著高于其他5种填料（P＜0.05）。因此，HBF工艺不同填料污水处理性能的差异主要是由生物膜的生物量及功能微生物组成两方面导致。

  本试验所用的填料包括酶浮填料（MT）、聚酯填料（JT）、涤纶填料（DT）、软性填料（RT）、弹性填料（TT）和组合填料（ZT）。采用人工裁剪方式，将前3种填料剪成条状（2cm×15cm），固定在ZT配套的骨架上，且底端固定填料以保证其在反应池中相对稳定的状态。6种填料性质及扫描电子显微镜（SEM）图分别如表1、图1所示。

1.2试验装置及运行工况


  采用有机玻璃反应器（图2）实施废水处理。反应器有效体积为6L，其污泥浓度（MLSS）为3000mg/L，DO为5mg/L，污泥回流比100%。反应器采用连续进出水，HRT设置为4~12h（表2）。人工配置的污水pH值为7.0，COD浓度为250mg/L，TN浓度为50~90mg/L，TP浓度为3mg/L及部分微量元素。

1.3水质指标与分析方法


  测定的水质指标有COD、氨氮（NH4+-N）及TN。采用高锰酸盐酸性法（GB11914—89）测定CODMn；采用纳氏试剂分光光度法（GB7481—87）测定NH4+-N；采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法（GB—11894—89）测定TN。


1.4生物膜量及微生物活性测定方法


  采用干重法定量评价生物膜负载量[5]。将含有生物膜的溶液用0.45μm滤膜（使用前称重）过滤，把滤膜置于温控105℃的恒温鼓风干燥箱内，干燥至恒重，过滤前后的质量差即为生物膜干重。结果取各反应器运行第20、30、45、60d及80d所测结果的平均值。采用TTC-还原法[10]对脱氢酶活性进行测定。结果取各反应器运行第20、30、45、60d及80d所测结果的平均值。


1.5微生物分析


1.5.1DNA提取及PCR扩增


  从每个反应器取适量的生物膜样本，用PowerSoilDNA提取盒（QbiogeneInc.,Carlsbad,CA,USA）按照DNA提取盒内说明书提取DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。PCR采用TransGenAP221-02:TransStartFastpfuDNAPolymerase。扩增采用的细菌16SrRNA引物序列为:338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'[11]；AOB引物序列为:amoA-1F:5'GGGGTTTCTACTGGTGGT-3',amoA-2R:5'CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3'[12]；NOB引物序列为:NSR1113R:5'-CCTGCTTTCAGTTGCTACCG-3'，NSR1264R:5'-GTTTGCAGCGCTTTGTACCG-3'[13]。


  采用50μL反应体系：10~100ng模板，25μL的2×TaqPCRMasterMix，1μL的25μmol/L引物，后用超纯水补至50μL。


  PCR反应步骤：95℃下预变性10min；95℃下变性15s，60℃退火60s，共40个循环。全部样本按照正式试验条件进行，每个样本设置3个重复。

1.5.2Miseq文库构建和Miseq测序


利用NEBNextDNA文库制备试剂盒（NewEnglandBiolabs公司，USA）在PCR产物两端加上短接头，构建出DNA文库。经MiSeqreagentkitV2试剂盒（Illumina公司，USA）处理后，委托美吉生物采用MiSeq测序仪进行测序。


1.5.3功能基因的荧光定量


  使用实时荧光定量PCR（real-timeqPCR）中SYBRGreen方法对AOB的amoA及NOB的NSR基因进行定量分析。试验中设置阴性对照，每个样品做3个平行，同时以梯度稀释的质粒DNA和样品DNA进行定量PCR反应。AOB及NOB定量所用引物参见上述普通PCR扩增。扩增体系均为20μL：SYBRGreenPremixEXTaq酶（Takara，大连）10μL，浓度为10pmol/LAOB及NOB正反向引物各0.8μL，DNA模板1μL，用超纯水补足至20μL。采用IQ5Thermocyler扩增仪（RG65HD，Corbett，Australia）进行定量PCR。定量PCR扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火60s，72℃延伸20s，共40个循环；最后在72℃延伸10min。


2结果与讨论


2.1填料对HBF反应器的污水处理效率的影响


  按试验方法，开展了填料对HBF反应器污水处理效率的影响试验，结果如图3所示。由图3(A)可知，不同填料反应器的CODMn去除效率均大致呈“升高-下降-平稳”的趋势，以MT反应器为例，在第7~19d，CODMn去除率从75.65%提高到97.32%；随着HRT的下降（从12h到8h，第21~35d），CODMn去除率先小幅下降后回升，该阶段平均去除率达95.40%；随着HRT的持续降低（从8h到4h，第36~50d），CODMn去除率从最高98.58%下降到最低77.76%，后逐渐回升至80%以上，该阶段测试期间平均去除率为87.16%。当HRT维持在4h时，即使进水NH4+-N浓度提高（从50mg/L到70mg/L（51~65d）再到90m/L（65~80d）），对CODMn去除率的影响较小，两个阶段测试期间CODMn的平均去除率分别为90.07%、88.44%。


  HRT减少导致CODMn去除率下降的主要原因可能是水力负荷加大，一方面造成反应器的有机负荷增加，另一方面过大的水力负荷对填料表面的生物膜产生了冲击[14]。反应器成熟后，即使进水NH4+-N浓度加大，CODMn去除率比较稳定，可能原因是好氧反应器内异养菌活性较大，受进水NH4+-N浓度影响不是很大[15]。


  总体来看，测试期间各填料反应器CODMn平均去除效率介于79.35%~91.72%，其排序为MT＞JT＞ZT＞DT＞RT＞TT；填料对CODMn的去除影响差异并不显著（P＞0.05）。

  由图3(B)可知，不同填料反应器的氨氮去除效率变化规律整体呈上升的趋势，中间有波动，整体平稳，后期去除率有所下降。以MT反应器为例，从第7~22d的NH4+-N去除率呈上升趋势，最高达96.27%。随着HRT的持续降低（从8h到4h，第36~50d），NH4+-N去除率有所下降，该阶段测试期间NH4+-N平均去除率为92.65%。当HRT维持在4h时，进水NH4+-N浓度从50mg/L提高到70mg/L，再到90mg/L，反应器对NH4+-N去除率影响不大，两个阶段测试期NH4+-N平均去除率为90.25%、89.57%。


  HRT减少导致NH4+-N去除率下降的主要原因可能是系统水力负荷加大，硝化菌没有足够的时间完成对NH4+-N的降解，使各反应器NH4+-N去除率存在波动。Liu等[16]研究表明，当NH4+-N负荷一定时，HRT的减小将造成NH4+-N转化效率下降。第四、第五阶段，HRT维持4h而NH4+-N浓度升高，导致NH4+-N去除率也有所降低，但变化并不明显，其主要原因可能是进水C/N比降低，有机碳源量要求较高的异养细菌部分被淘汰，降低了种群的多样性。据报道[17]称当进水C/N比减小时，自养菌会代替异养菌在生物膜外层生长繁殖。总体来看，测试期间各填料反应器的NH4+-N平均去除效率约67.12%~88.12%，其排序为MT＞JT＞ZT＞DT＞RT＞TT；填料对NH4+-N的去除影响差异显著（P＜0.05）。


综上可知，在不同工况下应用HBF工艺处理不同负荷的生活污水时，不同填料反应器对CODMn去除效率差异较小（P＞0.05），而NH4+-N去除效率差异显著（P＜0.05）。


2.2生物膜量及微生物活性分析


生物膜的形成与生长是实现污水处理的前提，生物膜量及活性是评价生物膜质量的重要依据[18-19]。在废水生物处理中，生物膜脱氢酶活性可反映处理体系中活性微生物量及其对有机物的降解活性，因而成为评价生物膜活性的指标[20]。因此，为揭示不同填料反应器的去除效率差异较大的原因，按试验方法测定了生物膜量及单位质量生物膜的脱氢酶活性，结果如图4所示。

  由图4(A)可知，不同填料的生物膜负载量及脱氢酶活性均差异显著（P＜0.05）。MT负载的生物膜量最大，其干质量达8.11g，而RT负载的生物膜量最小，其干质量为6.07g；该指标大小顺序为：MT＞DT＞JT＞ZT＞TT＞RT。图4中脱氢酶的活性结果表明：活性最高的是JT（208.55μgTF/(g生物膜•h)），活性最低的是RT（180.43μgTF/(g生物膜•h)）；填料的生物膜活性大小顺序为：JT＞MT＞ZT＞TT＞DT＞RT。由于不同反应器的NH4+-N的去除效率差异显著而对CODMn的去除效率差异较小，为定量评价两指标对污水处理性能的影响差异，分析NH4+-N去除率与生物膜量及单位质量生物膜的脱氢酶活性的相关性，结果如图4(B)、图4(C)所示。


由图4可知，NH4+-N去除率受生物膜量及单位质量生物膜的脱氢酶活性影响显著，其相关系数均大于0.50，微生物组成决定了微生物脱氢酶活性。为此，本研究进一步分析了生物膜中的微生物群落结构。


2.3生物膜中微生物群落结构分析


  按试验方法分析了生物膜的微生物群落。由样本的层级聚类分析（图5(A)）可知，六个样品中的微生物群落可以分为三个不同的类群：第一类包括样本S3、S5及S6；第二类为样本S2；第三类包括样本S1及S4。层级聚类分析结果与对生物膜样本的PCoA主坐标分析（图5(B)）结果一致。主坐标分析（Principalcoordinatesanalysis，PCoA），可用来研究微生物群落组成的相似性或差异性。由图5(B)可知，样本S3、S5及S6聚集在一起，S1与S4聚集在一起，且均与S2相距较远。以上结果说明不同填料上微生物组成存在差异。

  为进一步揭示其群落结构差异，基于细菌菌门水平（图6）、变形菌门（表3）及菌属水平（图7）分析生物膜上的微生物群落结构组成。由图6可知，从菌门水平来看，不同填料反应器中微生物群落组成的差异不是特别大。6种填料生物膜样本的主要菌群均为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）及放线菌门（Actinobacteria）。以MT反应器为例，其生物膜样本变形菌门占比达56.2%，其次是拟杆菌门（25.3%）、厚壁菌门（14.8%）。其他5种填料生物膜样本上的变形菌门占比介于28%~54.3%，拟杆菌门占比介于23.5%~57.3%，厚壁菌门介于9.2%~16.1%。该结果与前人研究结果相近，如Ma等[21]在序批式反应器中发现的细菌群落组成中变形菌门（占比最大）、拟杆菌门及放线菌门占优势；Snaidr等[22]在常规活性污泥中对菌群多样性的研究中发现变形菌门（Proteobacteria）为优势类群。在6个样品中还有绿弯菌门（Chloroflexi）、浮酶菌门（Planctomycetes）、绿菌门（Chlorobi）及单胞菌门（Gemmatimonadetes）等，但所占比例均不同。其中绿菌门在颗粒化过程中有重要作用，能够增强污泥的沉降性能。

  如表3、图7所示，从变形菌门微生物的分布、细菌菌属水平分析可看出填料的差异对微生物群落组成形成了显著差异。由图6可知，各填料生物膜样本中变形菌门的占比较大。变形菌门又分为五类，分别为α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲、δ-变形菌纲和ε-变形菌纲。国内外研究[23]发现，大多数在生物脱氮、生物除磷及诸多污染物降解过程中起重要作用的微生物均归属于变形菌门，其中β-变形菌纲包括某些AOB（包括亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和亚硝化螺旋菌属（Nitrosospira等））在内等很多好氧或兼性菌，且AOB是其主要成员[24-25]；γ-变形菌纲则包括肠杆菌科(Enterobacteraceae)和假单胞菌科（Pseudomonadaceae）等；δ-变形菌纲包括脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、脱硫菌属（Desulfobacter）及NOB类的硝化刺菌属（Nitrospina）等菌属。

  综合以上对生物膜上微生物的群落结构分析结果可知，不同填料反应器中的微生物组成还是存在较大差异的。其中MT反应器生物膜样本变形菌门占比最多。结合图3(B)各反应器对氨氮的去除率，MT生物膜相比于其他5种填料生物膜可能存在相对较多的硝化菌，且包括大部分脱氮菌的变形菌门也占比最多（56.2%）。这可能就导致MT反应器的污水去除效果较好。为进一步确定各反应器生物膜样本中硝化菌数量差异，本试验对生物膜样本上的硝化菌进行了功能基因（amoA、NSR）荧光定量PCR分析。


2.4生物膜硝化功能基因（amoA、NSR）荧光定量分析